I reagenti di crosslinking sono molecole contenenti due o più estremità reattive in grado di legarsi chimicamente a specifici gruppi funzionali (ammine primarie, sulfidrilici, ecc.) mediante un legame covalente.
I reagenti di crosslinking sono indicati per la coniugazione di biomolecole (proteine, peptidi, acidi nucleici e ormoni) tra loro o con qualsiasi gruppo molecolare che aggiunga proprietà utili come farmaci, radionuclidi, tossine, fluorofori, fotosonde, inibitori, enzimi e ligandi. Il loro utilizzo risulta utile per la stabilizzazione di strutture in cui si hanno interazioni proteina-proteina, proteina-peptide o peptide/proteina-piccole molecole, al fine di facilitare l’identificazione di relazioni tra proteine vicine, interazioni ligando-recettore, strutture proteiche tridimensionali ed associazioni molecolari nelle membrane cellulari.
Allo stesso modo, possono anche essere utilizzati per modificare acidi nucleici, farmaci e superfici solide, e nella preparazione di coniugati anticorpo-enzima e immunotossine.
I crosslinker sono utilizzati in un’ampia gamma di applicazioni nel campo della scoperta di farmaci, nello sviluppo di saggi e nella sintesi farmaceutica, per:
- la determinazione della struttura e/o della funzione delle proteine
- l’immobilizzazione di proteine o di altre biomolecole
- la coniugazione biomolecola-biomolecola in generale
- la coniugazione farmaco-anticorpo
I reagenti di crosslinking possono essere suddivisi in due macrocategorie: omobifunzionali e eterobifunzionali, a seconda che presentino due gruppi reattivi all’estremità identici o diversi. A differenza dei reticolanti omobifunzionali che si limitano a facilitare la coniugazione di molecole in una sola fase, i reticolanti eterobifunzionali permettono coniugazioni in due fasi.
Per la scelta del crosslinker, oltre alla reattività omobifunzionale o eterobifunionale, sono essenziali le seguenti proprietà:
- Specificità chimica (amino, tiolo, etc.)
- Lunghezza del braccio spaziatore
- Solubilità in acqua e permeabilità alle membrane
- Cross-link reversibile o irreversibile
- Possibilità di cross-link two-step
Alcuni esempi comuni di reticolanti omobifunzionali ammina-ammina includono, tra gli altri:
– DSS, ideale per la reticolazione del legante del recettore
– DST, usato per applicazioni in cui è richiesta la scissione del crosslink mantenendo intatti i legami disolfuro della proteina
– DSP, idealmente utilizzato per il crosslinking delle proteine intracellulari prima della lisi cellulare e dell’immunoprecipitazione, nonché per fissare le interazioni proteiche prima dell’identificazione di interazioni proteiche deboli o transitorie
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